Analiza UV-Vis w praktyce laboratoryjnej, co warto wiedzieć?

Spektrofotometria UV‑Vis umożliwia precyzyjne wyznaczanie właściwości i stężeń substancji na podstawie ich absorpcji promieniowania w zakresie 190-1100 nm. Technika opiera się na pomiarze zmian natężenia światła przechodzącego przez próbkę i stanowi jedno z podstawowych narzędzi ilościowej i jakościowej analizy laboratoryjnej.

Jak działa spektrofotometr UV‑Vis i z czego składa się układ pomiarowy?

Spektrofotometr UV‑Vis wykorzystuje źródło promieniowania, zwykle lampę ksenonową o stabilnym widmie, monochromator rozszczepiający światło na pojedyncze długości fal, kuwetę z próbką oraz detektor rejestrujący intensywność promieniowania. Monochromator kieruje wybraną długość fali przez roztwór, a detektor mierzy różnicę natężenia światła przed i po przejściu przez próbkę, przeliczając ją na absorbancję. Sprawny układ optyczny i stabilne źródło światła są kluczowe dla wysokiej powtarzalności pomiarów.

Nowoczesne urządzenia, w tym aparaty oferowane przez Biosens, integrują szybkie układy skanujące i stabilizację pracy lampy, co skraca czas analizy oraz zwiększa dokładność. Rozwiązania takie jak matrycowe detektory czy automatyczna kontrola parametrów optycznych dostępna w modelach Biosens umożliwiają pełne wykorzystanie możliwości techniki UV‑Vis w analizach rutynowych i badawczych.

Jak przygotować próbki do analizy UV‑Vis i dobrać odpowiednią kuwetę?

Próbka powinna być klarownym roztworem o absorbancji mieszczącej się w zakresie liniowości metody, zazwyczaj 0,1-1,0 A. Zbyt wysoką absorbancję redukuje się rozcieńczeniem, aby uniknąć błędów wynikających z nieliniowej odpowiedzi detektora. Dobór rozpuszczalnika wymaga uwzględnienia jego własnej absorpcji np. w analizach UV nie stosuje się szkła wodnego ani rozpuszczalników absorbujących poniżej 220 nm.

W zakresie UV niezbędne są kuwety kwarcowe, ponieważ przepuszczają fale od ok. 190 nm. W zakresie widzialnym można stosować kuwety szklane lub polimerowe. Kuweta musi być wolna od zarysowań, pozostałości detergentów i pęcherzyków powietrza, ponieważ każdy z tych czynników wprowadza istotne błędy absorpcyjne. W analizach biomolekuł coraz częściej wykorzystuje się mikrokuwety i techniki mikroobjętościowe, które pozwalają na oznaczanie stężenia DNA, RNA lub białek przy objętościach rzędu kilku mikrolitrów.

Jak wykonać pomiar absorbancji i skanowanie widma UV‑Vis?

Pomiar rozpoczyna się od wykonania odczytu dla próbki odniesienia zawierającej sam rozpuszczalnik. Następnie mierzona jest próbka właściwa, a urządzenie automatycznie oblicza absorbancję, wykorzystując zależność pomiędzy natężeniem światła padającego i transmitowanego. Precyzyjne ustawienie długości fali w monochromatorze jest kluczowe, szczególnie przy oznaczeniach wymagających dużej selektywności, np. dla pików absorpcji zlokalizowanych w wąskim zakresie spektralnym.

Skanowanie widma umożliwia identyfikację charakterystycznych maksimów absorpcji, ocenę czystości próbki oraz wybór długości fali do pomiarów ilościowych. Stabilność wyników zależy od regularnej kontroli parametrów optycznych i detektora. Kalibracja przy użyciu roztworów wzorcowych pozwala uzyskać rzetelne widmo oraz eliminuje dryft instrumentalny.

Jak obliczyć stężenie substancji metodą Lamberta‑Beera?

Prawo Lamberta‑Beera opisuje zależność absorbancji A od molowego współczynnika ekstynkcji ε, długości drogi optycznej l i stężenia c: A = εcl. W praktyce oznaczanie stężenia wymaga przygotowania zestawu roztworów wzorcowych o znanych stężeniach oraz wyznaczenia krzywej wzorcowej. Analiza liniowości tej zależności pozwala określić zakres roboczy metody i wykryć ewentualne odchylenia wynikające z zanieczyszczeń, jonizacji lub zmian pH.

Zastosowanie krzywej wzorcowej umożliwia obliczenie stężenia próbki nieznanej poprzez interpolację absorbancji na podstawie równania prostej kalibracyjnej. Metoda ta zapewnia wysoką dokładność i jest standardem w oznaczeniach ilościowych związków organicznych i nieorganicznych, w tym analitów stosowanych w laboratoriach farmaceutycznych i środowiskowych.

Zastosowania spektrofotometrii UV‑Vis w chemii i biotechnologii

Spektrofotometria UV‑Vis jest szeroko stosowana przy oznaczaniu kwasów nukleinowych, białek, związków przejściowych oraz reagentów reakcyjnych, dzięki czemu umożliwia ocenę czystości materiału biologicznego i monitorowanie reakcji enzymatycznych. W chemii analitycznej technika ta wspiera kontrolę przebiegu procesów, np. kinetyki reakcji, identyfikację produktów ubocznych czy ocenę stabilności związków.

W ochronie środowiska stosuje się ją do wykrywania azotanów, fosforanów i jonów metali w próbkach wody, często na poziomach śladowych. W przemyśle spożywczym służy m.in. do określania barwników, polifenoli oraz wskaźników świeżości produktów. Wszechstronność i wysoka powtarzalność pomiarów sprawiają, że technika ta jest jednym z kluczowych narzędzi rutynowej analityki laboratoryjnej.

Jak zwiększyć precyzję i dokładność w pomiarach UV‑Vis?

Dokładność pomiarów zależy od regularnej kalibracji urządzenia, kontroli stabilności źródła światła oraz utrzymywania czystości kuwet. Warto monitorować poziom szumów detektora oraz okresowo sprawdzać liniowość odpowiedzi przy użyciu roztworów referencyjnych. W pomiarach o wysokiej czułości kluczowe jest zapewnienie stałej temperatury próbki i eliminacja pęcherzyków powietrza.

Automatyzacja pracy spektrofotometru, możliwa m.in. dzięki rozwiązaniom stosowanym przez Biosens, ogranicza błędy operacyjne i usprawnia dokumentowanie wyników. Oprogramowanie rejestrujące przebiegi czasowe, archiwizujące widma i kontrolujące parametry optyczne pozwala wyraźnie zwiększyć powtarzalność analiz, szczególnie w laboratoriach wykonujących duże serie pomiarów.